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突破光學解析的極限—超高解析螢光顯微術 熱門指數 : 159
作者: 略識之無
中文名稱: 突破光學解析的極限—超高解析螢光顯微術   | 第一版 |
關鍵字: 光學顯微術,螢光顯微術,奈米光學

    眼睛是靈魂之窗,用眼睛「看」,是一種非常有效的的觀測方式。但是,當被觀看的物體太小,看不到或看不清楚時,人們會利用各種光學技術,如放大鏡,去觀察。不過,傳統的光學技術,有偵測上的極限(太小的東西看不到或看不清楚),只能觀察到次微米的尺度(大概是一根頭髮寬度的1/300),因此大幅限制了光學檢測技術的應用。在許多人的努力下,終於突破了此極限,開發出「超高解析螢光顯微術」,讓人們可以看到「奈米」的世界(等於或小於一根頭髮寬度的1/1000)。
圖一、利用(A)自發光源及(B)外來光源,來觀看物體之觀測方式示意圖。
    一般來說,當我們觀看一個物體時,需要三個基本物件:被觀察者、光、光感測器(如人的眼睛);而光源可以是自發光,或是外來光源。我們可以用圖一的示意圖來說明這兩種觀察方式的差異。圖一(A)中,被觀察者是一個燈泡,由於燈泡本身會發光,而發出來的光會入射到人的眼睛。而圖一(B)中,被觀察者是一個不會發光的足球,所以需要燈泡作為外來光源。燈泡發出的光入射到足球表面會受其影響而改變路徑,之後再射入人眼。無論是這兩種方式的哪一種,過程中,光都會與被觀察者產生交互作用,而改變其方位、強度甚至顏色。換言之,這些光會帶著被觀察者的形貌資訊進入人的眼睛,之後眼睛會再將所收到的訊息傳送到大腦,並由大腦解析出被觀察者的影像。
圖二、兩個亮點的空間解析能力示意圖。
    當我們得到了被觀察者的影像,並不代表我們就能知到所有被觀察者的形貌細節。事實上,無論是哪種光感測器,其解析能力都有其極限(也就是太小的東西看不到),此極限被稱為「空間解析度」,我們可藉由圖二的示意圖來理解。當我們觀察一個很小的物體時,由於細節看不清楚,所以看起來就會像是一個「小點」,同理,觀察兩個很小的物體時,看起來就會是兩個小點。假設這兩個小點就像圖二中的兩個藍色亮點,當這兩個亮點距離夠遠的時候,我們可以很容易鑑別出這兩個點,如圖二的左圖所示。當這兩個點靠近,甚至有部分疊合,只要沒有疊合的太嚴重,我們仍勉強可以解析出有兩個亮點,如圖二的中圖所示。但是當這兩個亮點疊合的太嚴重,我們就很難分辨出有兩個亮點,而會將之視為只有一個亮點,如圖二的右圖所示。當這兩個亮點接近到恰好勉強可以分辨出有兩個點(也就是再近一點,就會視為一個點)的狀況下,兩個亮點中心到中心的距離就稱為空間解析度。事實上,空間解析度會與被觀察者與光感測器的距離有關。比方說,筆者有近視眼,做視力檢查時,只能看到視力檢查表上最上面兩排圖案的缺口方向,但是若走近的話就連最下面這排的小圖,也看得清清楚楚。換言之,在近距離下,人眼的空間解析度會比較高。那是不是,光感測器與被觀察者的距離越近,空間解析度就越高呢?實際上並不是這樣,例如我們在看書的時候,會將書本與眼睛調整到適當的距離,太近反倒看不清楚。所以當被觀察者與光感測器的間距在某種特定距離時,這個感測器的空間解析度最佳。
圖三、藉由放大,增加空間解析度之示意圖。
  當想觀察的物體太小,眼睛的解析能力不足,要怎麼辦呢?這時就叫要借助儀器,例如光學顯微鏡,將物體放大。例如圖三左邊的示意圖中,有兩顆靠的很近的足球。我們不容易憑肉眼判斷,它們是否有碰在一起。這時,將影像放大(如圖三右邊的示意圖),就可以清楚的看出它們沒有接觸。但是無論再怎麼放大,傳統光學技術都有其學理上的極限。例如,人們使用綠光雷射作光源時,最好的光學顯微鏡所能提供的空間解析度大概是250奈米(約略是一根頭髮寬度的1/300),更小的尺寸,就看不清楚了。這時就需要超高解析螢光顯微術。
圖四、解析兩個無法鑑別的亮點之概念示意圖。
    目前已經開發出了許多不同種類的超高解析螢光顯微術,本文介紹其中一種,「光啟動定位顯微術」(Photo-activated localization microscopy,PLAM)。PLAM的基本構思可用圖四的示意圖來理解。圖中有兩個亮點因為過於靠近而無法分辨。這時,我們讓右邊的亮點暗掉(只有左邊的點會亮),這樣就可以標示出左邊亮點的中心位置(如圖四中,右上角紅點的位置)。接著,點亮右邊的亮點,並讓左邊的亮點暗掉,這樣就可以標示出右邊亮點的中心位置(圖四中,中下方紅點的位置)。最後,組合兩個中心位置,就可以將兩個亮點的位置解析出來,如圖四中的左下方圖。更進一步,若現在有許多很接近的亮點,利用類似的方法,就可以將所有亮點的位置標示出來。現在問題來了,這些亮點不是燈泡,也沒有開關,我們要如何控制他們的亮暗呢?實務上,我們會用「螢光染色」的 方式來處理。
圖五、PALM技術之基本概念示意圖。
  所謂螢光是指,某些物質在照光後,會發出特定顏色的光的一種現象。發出的螢光強度回隨著照射的光強度增加而增加。而螢光物質,可以由許多很小的「螢光分子」構成。PLAM就是利用染色的方式將螢光分子黏在想要觀察的樣品表面,而每個分子,就像一個的小燈泡,可以獨立發螢光。圖五為PLAM的基本概念示意圖。若圖中藍色的橢圓是要被觀察的樣品,利用染色的方式,讓樣品表面吸附很多小螢光分子(如圖五中的小圓圈)。沒照光時,這些螢光分子不發光(如圖五中白色的小圓圈)。要讓所有分子發螢光,就要照射足夠強的光;若光強度不足,就只能讓一部分的分子發光。若入射光的強度很弱,這時就只會有少數的螢光分子會發螢光(如圖五中紅色的小圓圈)。當人們用光學顯微鏡觀察時,由於大部分的分子不發光,而少數發光的分子又太小(顯微鏡看不清楚細節),因此這些發光分子看起來就像是一個個小亮點。藉此,人們可以標示出亮點的位置。重複這項照光及標示亮點位置的動作,就會發現每張光學顯微鏡的影像中亮點的位置都不一樣。這是由於每個螢光分子多少都會有些差異,而量測的環境,也會隨著時間的不同產生少許的變化所致。若我們取很多張影像並標示出每張影像亮點的位置,並將所有亮點的位置組合再一起,就會得到所有螢光分子的分布圖(如圖五中的左下方圖)。由於螢光分子是黏在樣品的表面,只要螢光分子夠多,那麼螢光分子的分布實際上就反映出樣品的形貌。
圖六、大腸桿菌之顯微影像量測實例。圖(A)及(B)為利用傳統光學顯微術量測到的影像;圖(C)及(D)則是利用PALM量測到的影像。圖中的比例尺代表1微米。(圖片取材自WIKPEDIA。)
  圖六顯示一個PLAM量測大腸桿菌的實例。其中(A)及(B)分別是兩種不同的傳統光學顯微術所量測到的影像;而(C)及(D)則分別是搭配兩種不同的光學顯微術所量測到的PLAM影像。大家可以很清楚的看到PLAM之影像的解析度遠高於傳統光學顯微術之影像。
    超高解析螢光顯微術目前廣泛的應用在生醫領域,用於量測各種生物樣品的形貌。由於這項技術可以將量測解析度提升到奈米尺度,讓研究人員可以探索奈米尺度的生物世界,因此對微觀的生物研究,例如細菌行為的探索,有非常大的助益。所以,這項技術預計將可大幅增進生醫領域的進展。
 

參考資料
老師文章總評: 全文建議加入幾個小標題,讓架構一目了然。其他沒有問題了。  
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